脊髓性肌萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一（yī）种常（cháng）染色（sè）体隐性遗传病，居儿童致死性常染色体隐性遗传病的第2位（wèi）。位于染色体5q11.2～q13.3上的运动（dòng）神经元（yuán）存活（huó）基（jī）因（Survivalmotorneuron，SMN）是（shì）SMA的主要致病基因。

　　人基因组有两（liǎng）个紧（jǐn）邻的高（gāo）度同源的SMN基（jī）因（yīn）：端粒侧的SMN1和着丝粒（lì）侧的（de）SMN2，两（liǎng）者（zhě）仅有（yǒu）5个碱基不同（tóng）。SMN1是主要功能基因，该基因突变可导（dǎo）致SMA发病，SMN2为临床表型的调节基因，影响病情的严（yán）重程度，其拷贝数增加（jiā）可减轻SMA表型。目前已（yǐ）知约94％的（de）SMA患者（zhě）为SMN1基因第7和（或）第8外显子纯合缺失所致（zhì），少数病例可由SMN1基因点突变或小的缺失引起。

　　SMN1基因外显子缺失检测的意义

　　SMA在人群中的发病（bìng）率（lǜ）为1/5000～1/10000，群体（tǐ）携带者频率为1/35～1/50，是（shì）出生缺陷的高（gāo）危因素，因此极有（yǒu）必要进（jìn）行SMA携带者的人群筛查，并（bìng）通（tōng）过产前诊断技术降低人（rén）群中SMA患儿（ér）的（de）出（chū）生（shēng）率。

　　临（lín）床上将（jiāng）SMA分（fèn）为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即（jí）婴儿型、中间型和少年型（xíng），严重程度依次（cì）递减（jiǎn）。神经专科医生一（yī）般根据患者发病年龄、临（lín）床表现及病情进展程度进行临床（chuáng）诊断，辅助（zhù）检（jiǎn）查（chá）方法包括肌（jī）电（diàn）图、肌酶和肌肉活（huó）检，结合家族史和（hé）SMN1基因分析可进行确诊。由于SMA患儿中（zhōng）约94%为SMN1基因外（wài）显子纯（chún）合缺失，因此，SMN1基因缺失检测对（duì）于SMA的诊断具有（yǒu）更高（gāo）的（de）灵敏（mǐn）度和特异（yì）性。且对不同型（xíng）的SMA患者，SMN1纯合缺失率没有显著差异，所以，SMN1纯合缺（quē）失的检（jiǎn）测对于不（bú）同（tóng）型SMA患者具（jù）有相同的临（lín）床诊断价值。在欧美人群（qún）中，SMN1基因纯合缺失检测已成为诊断和排除诊断SMA的首选方法。

　　SMN1基因缺失（shī）检测试剂的现（xiàn）状

　　目前（qián），SMN1基因（yīn）外（wài）显子（zǐ）缺失检（jiǎn）测试剂较（jiào）为缺乏，临（lín）床检验实验室较为（wéi）公认的方法（fǎ）是PCR结合限制性片（piàn）段长度多态性（PCR-RFLP）的方法（fǎ）。但该（gāi）方法（fǎ）操作较为繁琐，且重（chóng）复性差，不（bú）利于标准（zhǔn）化，不易推广。同时（shí），这种方法只能检测出纯合缺失，无法（fǎ）确（què）认（rèn）杂合缺失。

　　荷兰的SMAMLPA检测试（shì）剂可对待（dài）测靶（bǎ）序（xù）列进行半定量分（fèn）析（xī），因（yīn）此既可检测纯合缺（quē）失，亦可确认杂合缺（quē）失。在国（guó）内外已有多篇文献报道采用（yòng）该方（fāng）法进行SMA患者（zhě）诊（zhěn）断和SMA携带者筛查。但（dàn）该产品目前仍（réng）为“仅（jǐn）用于研究”的试剂，尚未按照体外诊断类（lèi）医（yī）疗器械上（shàng）市（shì）（98/79/EC）。

　　2015年底（dǐ），原（yuán）国家食品药品监管总局（jú）批准了第一项SMN1缺失突变检（jiǎn）测试（shì）剂（jì）上市。该产品采用多重（chóng）实时荧光MGB-TaqMan探针PCR法（fǎ），以人基因（yīn）组单拷贝基因RPP40为内参基因，对SMN1基因第7外显子和（hé）第8外显子（zǐ）拷（kǎo）贝数进行相（xiàng）对定（dìng）量检测，用于SMA患者的体（tǐ）外辅助分子诊断。SMN1基因外（wài）显子缺失检测的（de）难（nán）点（diǎn）之一在于排除高（gāo）同源性基因SMN2的干扰，特别是对于SMN2高拷贝数的受试者（zhě），需保证结果的（de）准确可靠（kào）。该产品通过（guò）对实时荧光PCR相对定量、绝对定量技术进行系统整合，并在反（fǎn）应体系（xì）中加入特定（dìng）化学组分，以抑制（zhì）PCR引（yǐn）物3’端（duān）的胞嘧啶（C）与（yǔ）胸腺嘧啶（T）的错配，增加（jiā）PCR扩增的特异性，从而有效控（kòng）制SMN2基因非特异性扩增对检（jiǎn）测结（jié）果（guǒ）的（de）影响（xiǎng），准确检出高拷贝数SMN2样本中SMN1基因（yīn）第7和第8外显子的（de）缺失情况。

　　鉴于国内外（wài）尚无（wú）任何按照体外诊断（duàn）试（shì）剂（jì）批准上市的SMA分子诊断产品，因此临床试验方案中（zhōng）依（yī）据（jù）EMQN关于《SMA分子（zǐ）诊断最佳实践指南》，采用（yòng）了（le）国内外SMA体外（wài）辅助（zhù）分子（zǐ）诊断领域公认的PCR-RFLP法作为对照方法。临床（chuáng）试验共完成1069例，其中（zhōng）正（zhèng）常（cháng）对照组777例，SMA病（bìng）例组292例（lì），统计分析结（jié）果显示申（shēn）报产品与对比（bǐ）方法检测结（jié）果的一致性为100%（95%置信区间：99.66%～100%）。此外，9747例正常成年人（rén）大（dà）样本中目（mù）标（biāo）外显子△△Ct分布范围的调查亦显（xiǎn）示，该产品的纯合突变判断界值设置合理。

　　该（gāi）试剂目前批（pī）准的预期用途仅（jǐn）包含（hán）纯合（hé）缺失的（de）检测，尚不能（néng）用（yòng）于杂合缺失的检（jiǎn）测，因（yīn）此无法用（yòng）于SMA携带者的筛（shāi）查，这是该（gāi）产品的缺（quē）陷之一。

　　事实（shí）上（shàng），该产品在设（shè）计上已考虑到SMA携带者的检测，其检测原理是以待测样本中目标外显子（zǐ）荧光（guāng）信号Ct值与内参基因荧光信（xìn）号Ct值之差（△Ct_s），与正常对（duì）照品三个梯度稀释品中目标外显子荧光信号Ct值和内参基因荧光信号Ct值之差的平均值（△Ct_a）之差，即△△Ct，作为待测样本（běn）中目标外显子拷贝数检测变量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根（gēn）据实时荧光定量PCR相对定量的基本数学原理推导得到申报产品检测变（biàn）量（liàng）△△Ct的计算公（gōng）式，依据这一计算公式可推导出纯合缺失、杂（zá）合（hé）缺（quē）失（shī）和（hé）野生型（xíng）的△△Ct理论值（或范围）；再（zài）结合目标（biāo）外显子与内参基因扩增效率（lǜ）差异以及SMN2不同拷贝数的影响，可对上述△△Ct理论值进行优化（huà）。结果显（xiǎn）示纯合缺失、杂合缺失和野生型的△△Ct值（或范（fàn）围）之间可设置合理的判断界值，因此理论上该产品可分别（bié）检测出三种基因状态。但鉴（jiàn）于生产企业对杂（zá）合缺失与野生型之间（jiān）的（de）判断界值研（yán）究尚不（bú）透彻（chè），再加上缺乏可判（pàn）定杂合缺失（shī）的对（duì）比方法等其他困难，本（běn）次注（zhù）册申请（qǐng）的预期用途（tú）仅（jǐn）限于检测纯合突变，即SMA患者（zhě）辅助诊（zhěn）断。

　　综上，SMN1基因外显子缺失检（jiǎn）测在（zài）SMA疾病诊断和（hé）SMA携带者筛（shāi）查中具有（yǒu）重（chóng）要的临床价值（zhí）。然而到目前为止（zhǐ），受到技（jì）术水平的限制，相关的（de）体外诊断试剂比较缺（quē）乏，特别（bié）是可用（yòng）于SMA携带者（zhě）筛查的杂合（hé）缺失（shī）检测，尚无适合的体（tǐ）外诊断试剂上市。（器审（shěn）中心审评六部  何静云）

来源：中国医药报